Em seguida, com o casamento do Imperador Dom Pedro I com a princesa Leopoldina da Áustria, vieram para o Brasil alguns dos maiores naturalistas do século XIX, como von Spix e von Martius, que trabalharam para o Museu. Outros pesquisadores europeus, como Auguste de Saint-Hilaire e o Barão Langsdorff, contribuíram para a coleção de exemplares botânicos do Museu Real quando em suas expedições pelo Brasil.

No decorrer do século XIX, refletindo tanto as preferências do Imperador Dom Pedro II quanto ao interesse do público europeu, o Museu Nacional passou a investir nas áreas da antropologia, paleontologia e arqueologia. O próprio Imperador, um entusiasta de todos os ramos da ciência, contribuiu com diversas peças de arte egípcia, fósseis e exemplares botânicos, entre outros ítens, obtidos por ele em suas viagens. Desta forma o Museu Nacional se modernizou e tornou-se o centro mais importante da América do Sul em História Natural e Ciências Humanas.

O Imperador ainda era uma figura muito popular no momento em que foi deposto, em 1889. Desta forma, os republicanos procuraram apagar os símbolos do Império. Um destes símbolos, o Paço de São Cristóvão, a residência oficial dos imperadores, tornou-se um local ocioso e que ainda representava o poder imperial. Então, em 1892, o Museu Nacional, com todo o seu acervo e seus pesquisadores, foi transferido da Casa dos Pássaros para o Paço de São Cristóvão, na Quinta da Boa Vista, onde se encontra até os dias de hoje.

Em 1946 o Museu passou a ser admnistrado pela Universidade do Brasil, atual Universidade Federal do Rio de Janeiro. Os pesquisadores e suas salas e laboratórios ocupam boa parte do Paço e alguns prédios erguidos no Horto Botânico, na Quinta da Boa Vista. No Horto ainda encontra-se a maior biblioteca científica do Rio de Janeiro. Atualmente, o Museu Nacional oferece cursos de pós-graduação ligados à Universidade nas seguintes áreas: Antropologia e Sociologia, Botânica, Geologia e Paleontologia, e Zoologia.

O Paço abriga a exposição de um dos maiores acervos das Américas de animais empalhados, minerais, coleções de insetos, utensílios indígenas, múmias egípcias e sul-americanas, meteoritos, fósseis e achados arqueológicos.

O Museu Nacional encontra-se aberto ao público de terça a domingo, a partir das 10h.