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PCR |
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PCR
é o acrónimo de Polymerase Chain Reaction
(em português - reacção em cadeia da
polimerase). |
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PCR
é o acrónimo de Polymerase Chain Reaction
(em português - reacção em cadeia da
polimerase). É um método de amplificação
(de criação de múltiplas cópias)
de DNA (ácido desoxirribonucleico) sem o uso de um
organismo vivo, por exemplo, Escherichia coli (bactéria)
ou leveduras.
História
O
processo de PCR foi inventado por Kary Mullis no início
da década de 1980, tendo-lhe sido posteriormente
atribuído o Prémio Nobel da Química
pelo seu trabalho. Em 1989, a Hoffman La Roche & Perkin-Elmer
Corporation patenteou este processo. O método PCR
é usado habitualmente nos laboratórios de
investigação médica e biológica
para uma variedade de tarefas, como a detecção
de doenças hereditárias, a identificação
de "impressões digitais" genéticas,
a construção de árvores filogenéticas
(árvores de relação entre espécies),
a clonagem de genes (ver adiante), e testes de paternidade.
Método
O
método PCR pode ter início com uma quantidade
muito pequena de DNA original - até mesmo o DNA deixado
em uma impressão digital pode ser usado. Durante
o processo PCR, o DNA original é copiado por uma
enzima, chamada DNA polimerase, que duplica a cadeia de
DNA. Geralmente, só uma pequena parte da cadeia de
DNA é copiada usando PCR. Esta parte é seleccionada
por iniciadores (primers), curtas cadeias artificiais de
DNA (20-40 pares de bases), que se combinam exactamente
com cada região terminal da parte a ser copiada.
Além do DNA original (que vai servir de base para
providenciar as cópias), dos iniciadores e da polimerase,
é ainda necessária a presença de desoxirribonucleótidos
- as unidades básicas da cadeia de DNA.
A
máquina de PCR (termociclador) é basicamente
um forno onde um programa controla o tempo e a temperatura.
O processo de PCR consiste em várias iterações,
geralmente 15-30, e cada iteração é
composta pelos passos seguintes: |
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Desenho
esquemático de um ciclo PCR. (1)
Desnaturação a 96ºC.
(2) Emparelhamento a 68ºC.
(3) Alongamento a 72ºC (P=polimerase).
(4) O primeiro ciclo está completo.
As duas cadeias de ADN resultantes compõem
um ADN modelo para o próximo ciclo, duplicando
assim a quantidade de ADN duplicado em cada novo
ciclo. |
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1.
Desnaturação
(94-96ºC,
30-600 segundos). Durante a desnaturação,
a cadeia dupla do DNA é separada em duas cadeias
simples, da mesma forma que se abre um "fecho-éclair".
A DNA polimerase é estável a altas temperaturas
pois é obtida de organismos que vivem em ambientes
extremos (extremófilos). A DNA polimerase mais
usada é a Taq polimerase (obtida de Thermus aquaticus).
2.
Annealing
(emparelhamento)
(45-80º C, 30-120 segundos). Durante o emparelhamento,
os iniciadores ligam-se ao DNA de cadeia simples e a DNA
polimerase liga-se aos iniciadores emparelhados.
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3.
Alongamento
(65-80º
C, 30-120 segundos). Durante o alongamento, a DNA polimerase
cria a cadeia de DNA complementar à medida que
percorre o DNA de cadeia simples, incorporando desoxirribonucleótidos
presentes na reacção.
O
bloco de iteraçoes é precedido por um passo
único de desnaturação, a fim de assegurar
que todo o DNA da amostra se encontra na forma de cadeias
simples. Após o bloco de iteraoes é comum
haver um passo extra de alongamento para que a polimerase
possa completar todas as novas cadeias formadas. Após
cada iteração, a quantidade de DNA duplica.
Assim, após múltiplas iterações,
o aumento da quantidade de DNA é previsto por uma
exponencial de base 2. Por exemplo, após 30 iterações,
uma cadeia de DNA é copiada em 230 = 1 073 741
824 cadeias, que são cópias exactas da parte
da primeira cadeia seleccionada pelos iniciadores.
Aplicações
O
PCR encontra sua principal aplicação em
métodos que necessitam de uma quantidade de DNA
maior que a disponível. Em teoria, é possível
amplificar qualquer DNA. Uma das principais aplicações
do PCR é na medicina forense, onde pequenas amostras
de DNA retiradas da cena de um crime (pedaços de
cabelo, gotas de sangue ou saliva, pedaços de pêlo
ou até mesmo a minúscula quantidade de DNA
deixada em uma impressão digital) são amplificadas
para serem analisadas pelo método de fingerprinting.
O PCR também é utilizado para amplificar
sequências de DNA para sofrerem mutagênese,
para detectar mutações ou para preparar
fragmentos a serem utilizados em outros experimentos (inserção
em vetor de expressão, por exemplo).
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| Licenciado
sob a GNU Free
Documentation License. Fonte de Wikipédia
PCR. |
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