O
Southern blot é um método
da biologia molecular que serve para verificar se uma determinada
seqüência de DNA está ou não presente
em uma amostra de DNA análisada. Isso é feito
por meio do realce do resultado de uma eletroforese em gel
de agarose, conforme será descrito mais adiante.
O método foi batizado com o nome de seu inventor,
o biólogo britânico Edwin Southern, e isso
fez com que outros métodos de blot fossem batizados
com trocadilhos ao nome de Southern, por exemplo, Western
blot e Northern blot.
Método
Denaturação
O
gel onde foi feita a eletroforese de DNA é tratado
com uma solução alcalina (tipicamente contendo
hidróxido de sódio) para provovar a denaturação
da dupla fita do DNA, separando-a em simples fitas. A
denaturação é necessária porque
o DNA nas etapas seguintes irá aderir à
membrana e irá parear com a sonda.
Transfrerência
do DNA para uma membrana
Uma
membrana de nitrocelulose (ou, alternativamente, nylon)
é posta sobre o gel. Uma pressão é
aplicada uniformemente sobre o gel (tanto usando-se sucção,
ou pondo-se sobre a membrana uma pilha de toalhas de papel
com um peso em cima). Isso faz com que o DNA passe do
gel para a membrana, onde ele se adere.
A
membrana é então aquecida (no caso da nitrocelulose)
ou exposta a radiação ultravioleta (no caso
do nylon) para permanentemente ligar o DNA à membrana.
Tratamento
com a sonda
A
membrana é agora tratada com uma sonda hibridizadora
- que é uma molécula de DNA isolada cuja
seqüência é conhecida e é idêntica,
ou então complementar, àquela seqüência
a qual se quer determinar a presença ou não
na amostra (como as duas fitas da dupla hélice
do DNA são complementares uma a outra, tanto faz
escolher uma sonda que seja idêntica ou complementar
à seqüência procurada). A sonda de DNA
é marcada de tal forma que permita ser detectada
a sua presença, essa marcação é
normalmente feita incororando-se a ela átomos radioativos
ou ligando-se a ela corantes fluorescentes ou cromogênicos
(substâncias incolores que produzem cor ao interagirem
com um determinado meio). Em alguns casos, a sonda hibridizadora
pode ser feita de RNA, em vez de DNA.
Essa
sonda irá parear com qualquer seqüência
de DNA complementar a ela. Portanto se a seqüencia
procurada não estiver presente na amostra não
haverá o pareamento.
Então
o excesso de sonda é lavado da membrana, e toda
a sonda não hibridizada (pareada) será removida.
Depois disso, a presença ou não da sonda
na membrana (e as posições onde ela está
presente) é revelada por uma auto-radiografia em
um filme de raio-x, ou pelo aparecimento de uma cor caso
a marcação cromogênica tenha sido
usada.
Resultados
As
manchas no Southern Blot abaixo mostram onde a sonda se
hibridizou com a amostra. E conhecendo-se os pontos onde
a amostra de DNA foi clivada, é possível
então dizer em quais trechos a seqüência
procurada está ou não presente.
